Penisilin alami dianggap sebagai obat pilihan untuk beberapa infeksi yang disebabkan oleh organisme aerobik gram positif yang rentan, seperti Streptococcus pneumoniae, streptokokus grup A, B, C, dan G, streptokokus grup D nonenterokokus, streptokokus grup viridans, dan stafilokokus penghasil nonpenisilinase. Aminoglikosida dapat ditambahkan untuk sinergi melawan streptokokus grup B (S. agalactiae), S. viridans, dan Enterococcus faecalis. Penisilin alami juga dapat digunakan sebagai agen lini pertama atau kedua melawan basil aerobik gram positif yang rentan seperti Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, dan Erysipelothrix rhusiopathiae. Penisilin alami memiliki aktivitas terbatas terhadap organisme gram negatif; namun, mereka dapat digunakan dalam beberapa kasus untuk mengobati infeksi yang disebabkan oleh Neisseria meningitidis dan Pasteurella. Mereka umumnya tidak digunakan untuk mengobati infeksi anaerob. Pola resistensi, kerentanan dan pedoman pengobatan bervariasi di berbagai wilayah.